Desarrollo de un sistema innovador de qPCR multiplex y método de muestreo para la detección eficiente y de bajo costo de virus en Prunus

Desarrollo de un sistema innovador de qPCR multiplex y método de muestreo para la detección eficiente y de bajo costo de virus en Prunus

Por: Dra. Cecilia Ramos B., Académica UDLA; Sebastian Gonzalez P. y Héctor García O., Laboratorios Diagnofruit Ltda, hgarcia@diagnofruit.cl.

Proyecto liderado por Diagnofruit e impulsado por la Fundación para la Innovación Agraria (FIA).

La producción de Prunus, cerezas, duraznos, nectarinos, ciruelas y damascos, es una importante actividad económica a nivel mundial. Actualmente, en Chile son los árboles más populares de la industria frutícola, particularmente las cerezas que alcanzaron 415.398 toneladas exportadas en 2022-23, lo que equivale a 83,1 millones de cajas de 5 kg, con ingresos estimados FOB (free on board) cercanos a US$ 2.300 millones. 

A pesar de este gran éxito, estos cultivos son susceptibles a una amplia gama de enfermedades virales, lo que puede provocar pérdidas significativas en la producción y calidad de los frutos, afectando la rentabilidad de los productores, volviendo crucial el diagnóstico y monitoreo para la sostenibilidad de la industria.

La detección del virus Prunus Necrotic Ring Spot Virus (PNRSV) en cerezas chilenas por parte de China en 2021 ha traído a escena, y en primera fila, a los virus en el país.  Sin embargo, esta problemática no es algo de reciente data, ya en los años 50 se informaron los primeros casos de virus en frutales en Chile. La llegada de las técnicas moleculares revolucionó al rubro agrícola, y desde el año 2000 las investigaciones en virus han ido aumentando, con énfasis en la detección temprana y manejo de éstos y logrando, hoy, el desarrollo valiosas iniciativas con el objetivo de generar respuestas rápidas, confiables y de bajo costo. 

En este sentido, ante el escenario actual de cambio climático, globalización, acelerado cambio varietal y generación de monomercados, el riesgo de detección de plagas y enfermedades ha aumentado. De forma particular, el crecimiento sostenido experimentado por la industria nacional de Prunus, influenciado por el cultivo del cerezo, ha puesto la atención sobre el desarrollo local de estrategias de manejos fitosanitarios y en el área de las enfermedades, y en este sentido las víricas son siempre las que poseen la menor dedicación, por este motivo proyectos que profundicen en esta problemática son esenciales para la producción sustentable.

Una rama con hojas verdes

Descripción generada automáticamente con confianza media

Figura 1. Sintomatología asociada a virus en Ciruelo var. Blue Gusto.

Es importante destacar que los virus en las frutas de hueso pueden ser difíciles de detectar, ya que no siempre hay síntomas visibles, lo que conduce a la propagación de la enfermedad de manera silenciosa. Por lo tanto, contar con protocolos estandarizados, sensibles, rápidos y de bajo costo para su detección en la industria de las frutas de hueso es clave. En este sentido, la iniciativa contribuirá de manera significativa su identificación, lo cual es facilitará la implementación de medidas efectivas de control, prevención y evitar la propagación de virus a otras áreas geográficas.

Actualmente, la técnica más comúnmente utilizada para encontrar virus en plantas es la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Pero, la mayoría de los ensayos de PCR existentes son uniplex, lo que significa que solo pueden detectar uno a la vez, lo que resulta costoso e ineficiente.

De esta forma el proyecto “Desarrollo de un sistema innovador de qPCR multiplex y método de muestreo para la detección eficiente y de bajo costo de virus en Prunus, liderado por Laboratorios Diagnofruit Ltda e impulsado por la Fundación para la Innovación Agraria (FIA) y asociados entre los que se cuenta Universidad de Las Américas y las exportadoras de frutas: Frusan, Mace, Ranco Cherries (Exportadora Rancagua) y Prize, tiene por objetivo resolver esta problemática mediante el desarrollo de un innovador sistema de muestreo  y un análisis de PCR en tiempo real multiplex, altamente sensible y específico, para la detección simultánea de varios virus que afectan a los Prunus, generando un servicio más barato y  de alta sensibilidad.

El proyecto se centra en el desarrollo de protocolos de RT-qPCR asociados con sondas altamente sensibles, específicas, eficientes y de bajo costo, con un perfil local. Esta última característica se logrará a través del estudio en profundidad de la composición genética de las poblaciones de virus de Prunus en Chile, utilizando secuenciaciones de nueva generación (NGS por sus siglas en inglés) para crear una base de datos completa de las poblaciones nacionales de estos patógenos. Una vez conocidos los genomas de los virus más presentes en Chile, se desarrollarán partidores específicos asociados a sondas que permitirán en una misma reacción encontrar las variantes de estas especies. Además, como segunda herramienta se trabajará en un sistema innovador que permitirá la colecta de muestras sin enviar material vegetal al laboratorio de análsis. La idea es contar con matrices para la extracción de material genético en campo, optimizando su mantenimiento y facilitando el transporte al laboratorio, sin necesitar refrigeración, por ejemplo. 

Otro aspecto de la iniciativa es que está consignada bajo la modalidad de Bien Publico en las bases FIA, esto quiere decir que todos los protocolos generados serán de uso público, de esta forma Diagnofruit y sus asociados contribuyen a la generación de una industria sostenible de frutas de hueso, considerando el comercio seguro como valor clave en la cadena de venta.

El proyecto actualmente se encuentra en etapa de análisis bioinformáticos de resultados de las secuenciaciones realizadas en el extranjero, caracterizando virus de Prunus y sus variantes presentes en Chile, para continuar con el desarrollo de sondas y protocolos de RT-qPCR de detección de estos virus. En el futuro se realizarán extensiones de los descubrimientos, lo que incluirá manuales y capacitaciones para instalar las técnicas desarrolladas en laboratorios del ámbito nacional.

Patrón de fondo

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Figura 2. Extracciones de ARN a partir de Prunus spp. con sintomatología asociada a virus para NGS.

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