Hace unos años, China, el principal comprador de cerezas chilenas, comenzó un protocolo de vigilancia sobre uno de los fitovirus más comunes de Prunus en el mundo, el denominado Prunus Necrotic Ring Spot Virus, más conocido por su sigla PNRSV.
En dicho momento, se aumentaron considerablemente las medidas de detección para este virus, lo que refrescó el conocimiento sobre estos patógenos poco conocidos, muchas veces subestimados y que pueden afectar la productividad de forma directa, afectando la calidad de la fruta, o indirecta, afectando la sanidad total del árbol, comprometiendo estados fenológicos claves.
Como la prevención es la única arma de control efectiva descubierta a la fecha, Laboratorios Diagnofruit Ltda. con el apoyo de la Fundación para la Innovación Agraria (FIA) y un grupo de asociados y asesores especialistas desarrollaron protocolos de detección basados en la realidad de las poblaciones locales de virus, estableciendo además sistemas de muestreos más simples que facilitan los sistemas de monitoreos que se deben establecer para el control temprano de estos patógenos.
The gender Prunus compromete al menos unas 250 especies originadas en Asia central. Un entretenido artículo describe cómo cientos de años de intercambio comercial a través de la Ruta de la Seda, y junto a la domesticación y mejoramiento, ha permitido tener hoy en día las especies que consumimos de esta familia, como nectarines, duraznos, damascos, ciruelas y nuestras conocidas e importantes cerezas.En virtud de la importancia dentro del comercio de frutas y la dieta mundial, los virus y viroides que afectan a Prunus revisten también suma importancia, ya que generan pérdidas productivas y/o deterioro en la calidad de las frutas (fig. 1). A pesar de lo mencionado, aun la descripción de estos patógenos es limitada en Prunus, se reduce solo algunas especies (Tabla 1) y las herramientas moleculares, son bienvenidas para la caracterización y el buen diagnóstico de estos patógenos.
Como se muestra en la Tabla 1, si bien PNRSV y PDV podrían transmitirse por polen, lo que implica que el control del contagio es casi nulo, en otros pocos casos hay vectores (insectos, arañitas y nemátodos) involucrados en la dispersión, lo cierto es que todos los virus y viroides de Prunus son fácilmente transmitidos en la injertación u otras técnicas de propagación vegetativa.
Considerando todo lo anterior el control de enfermedades virales en frutales de carozo se basa esencialmente en medidas profilácticas, uso de cuarentenas ara material sospechoso, desarrollo de certificación de material vegetal, erradicación de plantas positivas, control de vectores y la eliminación de virus mediante termoterapia y cultivos in-vitro para generación de plantas sanas.
Por otro lado, y para complicar aún más el manejo, existe la conocida variabilidad genética de los virus. Ya aprendimos con SARS-CoV-2 (COVID-19) y su amplia gama de variantes genéticas: Alfa, Beta, Gamma, Delta y Ómicron, que aparecían y nos preocupaban cada semana en medio de la pandemia.
En el caso de los fitovirus el caso no es muy distinto. Estos patógenos tienen una alta capacidad de mutar y persistir con aún mayor virulencia, lo que también impacta en su diagnóstico, como luego explicaremos.
A la luz de todos los conocimientos generados a nivel mundial, varias dudas estaban presentes sobre los virus en Chile; prevalencia, variantes genéticas, detección confiable, se contaban como los aspectos más relevantes a resolver, a la hora, por ejemplo, de enfrentar restricciones paraarancelarias extremas (como la mencionada vigilancia China sobre las cerezas) y establecer una industria sostenible.
Con estas dudas, el equipo de Diagnofruit se volcó a la tarea de encontrar partners para resolverlas y con el apoyo de FIA, asociados de la academia como UDLA y directamente de la industria como PRIZE S.A., FRUSAN S.A., Exportadora Rancagua S.A.,MACE S.A., y Frutas de Chile (Comité de Cerezas de Chile-ASOEX) se logró llevar a cabo el proyecto: “Desarrollo de qPCR Múltiplex e Innovador Sistema de Toma de Muestras para Detección Eficiente y de Bajo Costo de Virus en Prunus” que por estos días está en etapa de finalización.
La primera parte del proyecto nos permitió trabajar con tecnología de punta y realizar un catastro de los virus presentes en Chile en Prunus a través de RNA-seq, lo que concluyó con secuencias completas de más de 10 patógenos virales, permitiendo conocer además variantes descritas y locales (Fig.2), conocimiento clave para entender la dinámica de las poblaciones virales a nivel local, ya que mínimos cambios pueden generar grandes efectos a nivel epidemiológico, virulencia, etc.
Dicha información de base permitió diseñar protocolos de qPCR adaptados para las poblaciones de virus presentes en Chile, asegurando un diagnóstico confiable.
De forma muy simple, considerando varias cepas de un mismo virus, buscamos sectores específicos en el genoma que nos permitieron desarrollar partidores para qPCR capaces de detectar todas las variantes del virus blanco, sin confundirse con otros virus ni tampoco con el material genético propio del vegetal (situación que podría ocurrir en protocolos de PCR de tiempo final).
Al mismo tiempo, sabíamos que uno de los problemas de realizar estos análisis es el costo individual por virus, por lo que nosotros agrupamos la detección. En otras palabras, en un mismo tubo de reacción se pueden detectar hasta 3 virus de forma simultánea, lo que se logró a través del uso de diferentes sondas, disminuyendo los costos en virtud de menor uso de mano de obra y reactivos, abarcando muchos más virus por el mismo precio o menor, en comparación a análisis convencionales inmunológicos (ELISA) o de PCR de punto final, que además son menos sensibles.
Otro aspecto que el proyecto quiso abordar fue simplificar la toma de muestras, para esto se probaron tarjetas FTA (Fig. 3) que permiten realizar muestreos en campo sin enviar material vegetal al laboratorio, evitando grandes volúmenes de muestras, espacio de trabajo y eventuales pérdidas de sensibilidad de la técnica debido a sometimiento a estrés de las muestras vegetales y disminución de los virus por este efecto y generación de falsos negativos.
El proyecto tuvo carácter de BIEN PÚBLICO, por lo que la información y, por supuesto los protocolos, están completamente disponibles para la industria nacional en distintas plataformas.
Como primer objetivo, el proyecto tenía la tarea de generar un completo manual de laboratorio (Fig. 4) que contiene los protocolos para las qPCR-multiplex y las indicaciones para el muestreo con tarjetas y obtención de material genético desde las mismas. Este manual, fue revisado por los principales laboratorios de diagnóstico del país, lo que fue realmente muy constructivo ya que en cierta forma el contenido fue validado por pares (Fig. 5).
Para descargar este manual puedes hacer click aquí.
Además, como tareas secundarias de extensión se realizaron diversas actividades, charlas informativas de avances y una final (Figs. 5), que fue llevada a cabo en junio con la presencia del Dr. Vicente Pallás, autoridad mundial en fitovirus, en especial de Prunus.
Esta presentación se realizó en las instalaciones de Copefrut S.A., en Curicó, con gran éxito de concurrencia y participación (Fig. 6) con jefes técnicos de exportadoras, viveristas, asesores y productores.
También fueron realizadas capacitaciones a personal de laboratorios externos en instalaciones de UDLA (Fig. 7) e in-situ, considerando además una sesión final exclusiva para el Servicio Agrícola y Ganadero (SAG) con el propósito de dar a conocer los protocolos para que el futuro sean probados por el organismo estatal.
Creemos que el estudio de poblaciones virales, el desarrollo de protocolos y un manual para la detección de virus en Prunus es el piso para el establecimiento de una industria de frutos de carozo sostenible, ahora esperamos que los laboratorios puedan habilitar la metodología y los productores, viveristas y exportadores envíen muestras a análisis con el propósito no sólo de conocer el estatus de plantaciones en producción, sino que lo más importante: diagnosticar nuevas plantaciones, recordando que el principal manejo de control es la prevención y partir con plantas sanas un nuevo proyecto es, sin duda, la base de una producción de calidad y de largo plazo.
